在二代測(cè)序基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的RAD-seq技術(shù)是一項(xiàng)基于全基因組酶切位點(diǎn)的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)。由于特異性酶切位點(diǎn)在全基因組范圍內(nèi)廣泛分布,通過(guò)RAD-seq能夠在大多數(shù)物種內(nèi)獲得數(shù)萬(wàn)至數(shù)十萬(wàn)的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)標(biāo)記。在此基礎(chǔ)上,RAD-seq技術(shù)又衍生出多種簡(jiǎn)化基因組測(cè)序方法,包含GBS,ddRAD,ezRAD以及2b-RAD等。其中,ddRAD-seq通過(guò)一個(gè)稀有酶與一個(gè)常見(jiàn)酶相結(jié)合對(duì)基因組DNA進(jìn)行雙酶切,免去隨機(jī)打斷的過(guò)程,是一種非常有前景的簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)。不過(guò),ddRAD技術(shù)雖然在建庫(kù)流程上比RAD做了一定程度的簡(jiǎn)化,但仍然包括12步,實(shí)驗(yàn)耗時(shí)較長(zhǎng)。因此,有必要對(duì)現(xiàn)有的ddRAD簡(jiǎn)化基因組測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法進(jìn)行改進(jìn),以克服其需要多次選酶、使用儀器復(fù)雜、成本偏高等缺陷,提高測(cè)序效率。
中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所博士研究生楊國(guó)騫在郭振華研究員與李德銖研究員指導(dǎo)下,與中科院海洋研究所李莉研究組一起,開(kāi)發(fā)出一種被子植物中通用的雙酶切簡(jiǎn)化基因組(Modified ddRAD,簡(jiǎn)稱MiddRAD)二代測(cè)序文庫(kù)構(gòu)建方法。該方法首先發(fā)現(xiàn)一種被子植物通用酶切組合“AvaII + MspI”,減少了不同物種間需要多次選酶的步驟;其次,該方法將復(fù)雜的建庫(kù)專用儀器優(yōu)化為通用的分子生物學(xué)儀器;再次,該方法將P1測(cè)序接頭由37個(gè)堿基簡(jiǎn)化為25個(gè)堿基(barcode按5個(gè)堿基計(jì)算)并設(shè)計(jì)出一套新的barcode-adapter體系;最后,該方法還減少了純化酶切產(chǎn)物、連接前定量及混樣后純化連接產(chǎn)物的步驟,簡(jiǎn)化了建庫(kù)流程,允許僅使用50ng DNA即可完成文庫(kù)構(gòu)建。該技術(shù)操作簡(jiǎn)單靈活、檢測(cè)成本低、檢測(cè)通量高,更易被科研人員掌握并能在通用分子實(shí)驗(yàn)室中實(shí)現(xiàn),特別適用于需要對(duì)大量個(gè)體進(jìn)行SNP標(biāo)記開(kāi)發(fā)及分型的遺傳圖譜構(gòu)建、系統(tǒng)發(fā)育分析及群體遺傳學(xué)等研究。因此,MiddRAD-seq在農(nóng)業(yè)分子育種、進(jìn)化生物學(xué)和保護(hù)生物學(xué)等領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用價(jià)值和推廣前景。
研究以 “Development of a universal and simplified ddRAD library preparation approach for SNP discovery and genotyping in angiosperm plants”為題發(fā)表于Plant Methods上。 鏈接:http://plantmethods.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13007-016-0139-1 本研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470322 、31430011)的支持。
MiddRAD(a)與ddRAD(b)實(shí)驗(yàn)流程圖
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